注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
p-Menth-8-ene-1,2-diol2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（二乙氨基）苯酚 98%碲化鉛 99.99%

p-Menthane-1,2,8-triol戊酸丁酯 ≥98.0 %L-谷氨酰胺 99%

p-Menthane-1,3,8-triol苯 光譜級(jí), ≥99.7%透明質(zhì)酸鈉 95%，來(lái)源：雞冠

Rehmapicroside5-[(5-溴-2-吡啶)偶氮]-2，4-二氨苯 AR甲基嘧啶磷 0.100mg/ml

Rosiridin鄰甲酚酞 AR,堿溶甲基嘧啶磷 100μg/ml,u=2%

Terpineol鄰甲酚酞 AR,溶甲基嘧啶磷 10μg/ml,u=3%

Furomollugin偶氮氯膦Ⅰ AR,顯色劑鷹嘴豆芽素A 98%

1,5-Dicaffeoylquinic acid鉻天青S AR隱丹參酮 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

1,2,3,4,6-O-Pentagalloylglucose鉻天青S IND金雀花堿 98%

1,2,3,6-Tetragalloylglucose鉻天青S ≥96%(HPLC)薯蕷皂素 90%

1,2-Benzenediol環(huán)己烷 for HPLC, ≥99.9%黃豆苷原 98%

1-(4-Hydroxy-2-methoxyphenyl)-3-(4-hydroxy-3-prenylphenyl)propane磷酸三鈣 AR, ≥96.0%刺芒柄花素 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

1,5-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)penta-1,4-diene鈣鎂試劑 Indicator章胺鹽酸鹽 98%

1,7-Bis(4-hydroxyphenyl)hept-1-en-3-one間甲酚  Standard for GC,≥99.7%(GC)吳茱萸次堿 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

1,7-Bis(4-hydroxyphenyl)hept-6-en-3-ol變色酸 AR虎杖甙  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

1,7-Diphenyl-4-hepten-3-one環(huán)戊酮 GCS,≥99.5% (GC)虎杖甙  97%

威標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.100mg/ml）CK2α AntibodyPERK  蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶抗體

劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/ml,溶劑：甲）Lck (L22B1) Mouse mAbperipherin  外周蛋白抗體

苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（100mg/L,溶劑：）CD3 (17A2) Rat mAb (redFluor™ 710 Conjugate)Periostin  成骨細(xì)胞特異性因子2抗體

苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,溶劑：甲）Emerin (L12) AntibodyPerilipin A+B  脂滴包被蛋白A+B抗體

苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.989 mg/ml,基體：甲）Phospho-Chk2 (Thr68) AntibodyPerilipin A  脂滴包被蛋白Perilipin-A抗體

氨標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,溶劑:）Phospho-Chk2 (Thr68) AntibodyPER2/Period circadian protein 2  節(jié)律蛋白2抗體

酰嘧磺?。?biāo)準(zhǔn)品）Phospho-Chk2 (Thr68) AntibodyPER1 protein  節(jié)律抑制蛋白PER1抗體

莠滅凈（標(biāo)準(zhǔn)品）Chk2 AntibodyPeptide YY/PYY  酪酪肽抗體

草毒死（標(biāo)準(zhǔn)品）Chk2 AntibodyPEPT2/SLC15A2  腸道肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抗體

正十六烷標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,基體：甲）GABARAPL1 (D5R9Y) XP® Rabbit mAbPEPT1  腸道肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1/小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抗體
塔那痘病毒PCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格3,3′,5,5′-Tetrabromobisphel A,97%通用試劑　100G

4-Ami-3-nitrophel,98%通用試劑　5G

2-Ami-4-nitrophel,≥99.0%通用試劑　10G

2-Ami-3-nitrophel,98%通用試劑　5G

8-Ami-2-naphthol,97%通用試劑　1G

2-Methylbenzenethiol,95%通用試劑　5G

5-?Chloro-?2-?(2,4-?dichlorophexy)?p...通用試劑　10G

2-(Trifluoromethyl)benzenethiol,96%通用試劑　1G

4-(Trifluoromethylthio)phel,98%通用試劑　5G

2,3,4-Trifluorophel,97%通用試劑　1G

1,2,4-Benzenetriol,99%通用試劑　1G

4-Ami-2,6-dichlorophel,98%通用試劑　5G

(±)-1,1′-Bi(2-naphthol),99%通用試劑　5G

3-Phenylphel,97%通用試劑　1G

2,3,4,6-Tetrachlorophel通用試劑　50MG
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。