注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Chrysin二烯基胺 98%2-基-β-D-吡喃半乳糖苷 99%，n-animal origin

Chlorpheniramine maleate二氯烯胺 97%對(duì)-α-D-葡萄糖吡喃苷 99%

6-APA1,3-二氯烷 98%β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 97%

2-Amithiazol-4-acetic acid1，6-二氯己烷 99%β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 99%

Citrinin二甲基二烯基氯化銨 60%溶液N-壬?；?N-甲基葡萄糖胺 99%

Gemcitabine5-硝基 98%1-萘磷酸單鈉鹽，一 98%

dFdCyd1，3- Standard for GC,≥99.5% (GC)4-基-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷 98%

Balofloxacin1,3- 分析標(biāo)準(zhǔn)品壬基-β-D-吡喃葡糖苷 98%

LVFX1,3- 98%n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷 97%

Clarithromycin1,3- 99.5%n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷 98%，用于蛋白分析

Gibberellin A3三烯基胺 97%辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷 99%

Gibberllin A4+72,3,5-三氯吡啶 99%鄰苯二酚紫 IND

Zeatin鎢粉 99.98% metals basis,1-5μm姥鮫烷 98%

Trans-Zeatin硒基酸 99%1-芘丁酸 99%

ABA硫酸 ACSD-潘糖 98%

Adenine硫氫化鈉，合 68-72 %5-磷酰核糖-1-焦磷酸鈉鹽 80%

鄰苯二甲(Standard for GC, ≥99.5% (GC))Aurora B/AIM1 AntibodyNET1  去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體抗體

對(duì)二甲苯(Standard for GC,≥99.8%(GC))Aurora B/AIM1 AntibodyNestin  巢蛋白/神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白抗體

間二甲苯(Standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-c-Abl (Tyr89) (61A6) Rabbit mAbNestin  巢蛋白/神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白抗體

鄰二甲苯(Standard for GC,≥99%(GC))JMJD1B (C6D12) Rabbit mAbNESG1/CCDC19  鼻咽上皮細(xì)胞特異性蛋白1抗體

二甲苯(Standard for GC,≥99.9%(GC)(二甲苯異構(gòu)體+乙基苯）)IGFBP1 (D4E9T) XP® Rabbit mAbNesfatin-1/Nucb2  新的飽食分子蛋白抗體

氣相色譜儀檢定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（苯-甲苯溶液）(5.00mg/ml,基體:甲苯)IGFBP1 (D4E9T) XP® Rabbit mAbNeprilysin 2  腦啡肽酶2抗體

液相色譜儀檢定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(萘-甲溶液)(0.0001g/mL,基體:甲)Smad2/3 AntibodyNephrin  腎小球細(xì)胞粘附分子受體抗體

3-氨基吡啶(標(biāo)準(zhǔn)品)Smad2 (L16D3) Mouse mAbNEK9  絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶NEK9抗體

順式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸甲酯(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Smad2 (Ser245/250/255) AntibodyNEK8  絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶NEK8抗體

2,6-二乙基苯胺(DEA)(標(biāo)準(zhǔn)品)Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) (D85B4) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)NEK7  絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Nek7抗體
中華鱉球狀病毒PCR檢測試劑盒價(jià)格磷酸化結(jié)蛋白抗體3,3-Dimethoxy-5α-androstan-17-one中文名：3,3-二甲氧基-5α-雄烷-17-酮?jiǎng)e名：分子式：C21H34O3

動(dòng)力相關(guān)蛋白1抗體3-Ethoxyandrosta-3,5-dien-17β-ol中文名：3-乙氧基雄-3,5-二烯-17β醇別名：分子式：C21H32O2

tch信號(hào)通路Delta樣配體4抗體17-Ethylendioxyandrosta-1,4-dien-3-one中文名：17-亞乙二氧基-雄-1,4-二烯-3-酮?jiǎng)e名：分子式：C21H28O3

溶酶體絲氨酸蛋白酶DPP2抗體3β-Acetoxy-5α-androstan-17β-ol中文名：3-乙?；?5α-雄烷二醇別名：分子式：C21H34O3

DIRAS2蛋白抗體17β-Benzoyloxy-androsta-1,4-dien-3-one中文名：17β-苯甲酰氧基-雄甾-1,4-二烯-3-酮?jiǎng)e名：分子式：C26H30O3
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。